導(dǎo)讀：普通農(nóng)夫的谷倉(cāng)里肯定沒(méi)有款的HiSeq測(cè)序系統(tǒng)。不過(guò)，這并不意味著新一代測(cè)序(NGS)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域就不如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域那么重要。

　　喬治亞大學(xué)的特聘教授Andrew Paterson就利用NGS來(lái)捕獲群體的多樣性，他將基因型與參考基因組進(jìn)行比較。他領(lǐng)導(dǎo)的植物基因組作圖實(shí)驗(yàn)室也利用NGS從不同個(gè)體中獲得許許多多的許可，“這樣我們可以了解誰(shuí)和誰(shuí)關(guān)系比較近”。

　　不管是研究玉米，還是研究小鼠，傳統(tǒng)的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)、生物信息學(xué)以及其他學(xué)科中的許多技術(shù)都是一樣的。然而，植物為研究人員帶來(lái)了一些*的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

　　多倍體

　　植物可能攜帶了基因組的多個(gè)拷貝，比如說(shuō)，面包小麥?zhǔn)橇扼w，而甘蔗的拷貝數(shù)多達(dá)200個(gè)。“即使是四倍體，我們都很少有高質(zhì)量的參考序列，更不用說(shuō)六倍體了，”HudsonAlpha生物技術(shù)研究所的Jeremy Schmutz談道。誠(chéng)然，亞基因組之間有足夠的差異，讓你將大多數(shù)基因與每條染色體的不同特點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，但并非全部。Schmutz說(shuō)，有很多東西，你無(wú)法說(shuō)出它們從哪里來(lái)，到哪里去，因?yàn)橛刑嗟目截?。甘蔗就更不用說(shuō)了。

　　通常情況下，人們對(duì)親本或祖先種或者模式生物開(kāi)展遺傳學(xué)和基因組學(xué)分析。短柄草(Brachypodium)的基因組就特別小;它常作為小麥或其他草類的替身。“重測(cè)序小麥可能需要Illumina HiSeq X Ten的半個(gè)流動(dòng)槽，這相當(dāng)于5個(gè)人類基因組。而短柄草只有350 Mb，因此你可以盡情測(cè)序，”Schmutz說(shuō)。你可以誘導(dǎo)突變，測(cè)定表型，如果你發(fā)現(xiàn)了一些有趣的，可以看看小麥中的相同基因做了什么。

　　參考呢

　　目前zui的植物基因組是水稻基因組，這主要是因?yàn)?ldquo;我們使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我們利用Sanger測(cè)序?qū)γ總€(gè)BAC(細(xì)菌人工染色體)進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序，”亞利桑那基因組研究所的Rod Wing教授談道。這個(gè)基因組于2005年發(fā)表。

　　Wing還參與了玉米基因組的測(cè)序，這也是通過(guò)BAC-by-BAC開(kāi)展的。不過(guò)那時(shí)，“我們沒(méi)有足夠的資金來(lái)完成每個(gè)BAC，因此*完成的是真正的基因部分，”Wing解釋道。zui近，人們利用短讀取技術(shù)測(cè)序了基因組，產(chǎn)生了缺乏大部分非編碼區(qū)域的基因組組裝。

　　NGS的zui大問(wèn)題之一是短讀取無(wú)法很好地對(duì)付重復(fù)片段，這可能占了基因組的一半?，F(xiàn)在有一種技術(shù)能夠很好地應(yīng)對(duì)，南伊利諾伊大學(xué)的David Lightfoot教授談道，那就是PacBio的長(zhǎng)讀取技術(shù)，它往往能夠跨過(guò)重復(fù)區(qū)域。Lightfoot的研究團(tuán)隊(duì)正準(zhǔn)備發(fā)表橄欖樹(shù)基因組，這就是結(jié)合短讀取和長(zhǎng)讀取測(cè)序的。

　　高分子量DNA

　　BAC、長(zhǎng)讀取測(cè)序、mate­pair文庫(kù)構(gòu)建，以及其他一些方法，都需要相對(duì)高分子量的DNA。“對(duì)于血液樣本而言，這很容易獲得，但是對(duì)植物來(lái)說(shuō)有點(diǎn)難，因?yàn)樗鼈兎e累了碳水化合物以及其他的代謝產(chǎn)物，可能降解DNA，”Schmutz說(shuō)。此外，葉綠體可能貢獻(xiàn)了10% 的DNA。去除它們，“這樣你就不會(huì)一而再、再而三地把錢浪費(fèi)在葉綠體的重測(cè)序上，”Lightfoot說(shuō)。他使用了各種方法，包括在黑暗中育苗(這也能去除淀粉)，從根部取樣，或者使用現(xiàn)成的試劑盒來(lái)分離細(xì)胞核。

　　Wing的團(tuán)隊(duì)不依賴試劑盒，而是裂解并離心細(xì)胞，然后用溫和的去污劑(如Triton™ X­100)重懸沉淀，裂解葉綠體和線粒體，但保持細(xì)胞核完整。“然后你就可以取出細(xì)胞核，純化出高分子量的DNA，用于PacBio或長(zhǎng)讀取測(cè)序，”他說(shuō)。為了制備BAC文庫(kù)，他的團(tuán)隊(duì)將DNA嵌入低熔點(diǎn)瓊脂糖中，創(chuàng)造出DNA多孔袋，讓純化DNA的酶和試劑可在其中擴(kuò)散。DNA則永遠(yuǎn)不會(huì)受到任何剪切力。

　　新應(yīng)用

　　目前，植物基因組學(xué)中的大部分經(jīng)費(fèi)都用來(lái)生成參考基因組。下一步是尋找作物的多樣性，并查看它們的野生親緣種。“在馴化過(guò)程中，你可能經(jīng)歷了消除所有變異的過(guò)程，不過(guò)事實(shí)證明，這種變異有望解決許多的農(nóng)業(yè)問(wèn)題，”Wing說(shuō)。密歇根州立大學(xué)的Rebecca Grumet教授及其團(tuán)隊(duì)正在尋找葫蘆科的抗病遺傳標(biāo)記(QTL)，特別是西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜，這zui終將幫助育種者輕松篩查抗病品種。遺傳標(biāo)記能幫助育種者混合多個(gè)性狀，抵抗多種疾病，還能帶來(lái)其他的優(yōu)良性狀。

　　她的團(tuán)隊(duì)是利用兩種測(cè)序法基因分型(GBS)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。*種是基于雙親交配：將抗病株與敏感株雜交，查看后代。它們都有全基因組參考序列，因此能夠找出性狀所在的位置。第二種是GWAS：他們計(jì)劃對(duì)每種作物的1000個(gè)種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)序，特別是它起源的區(qū)域。他們將利用這些信息來(lái)了解多少遺傳多樣性是來(lái)自那里，并建立核心種質(zhì)。

　　此外，許多其他的NGS技術(shù)，比如RNA­Seq，也將在植物學(xué)研究中大顯身手。如今測(cè)序已經(jīng)扎下了根，而隨著成本繼續(xù)下降，新一代的研究人員更加熟練，它的應(yīng)用必將開(kāi)花結(jié)果。

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