Kary Mullis博士也許并沒有想到，他發(fā)明的PCR技術(shù)能夠在未來三十年保持長盛不衰。這不僅要歸功于DNA聚合酶的發(fā)展，也要歸功于PCR儀的不斷升級。如今，反應(yīng)效率提高，反應(yīng)體積減少，使得PCR逐漸應(yīng)用在更廣泛的領(lǐng)域。選購PCR儀，似乎并不是一件難事。然而，對于一些關(guān)鍵的參數(shù)，你真的了解它們的意義嗎?

　　快速變溫

　　現(xiàn)在，快速PCR已成為一種潮流。反應(yīng)時間從90分鐘縮短到30分鐘，是受歡迎的，畢竟誰也不想在預(yù)約PCR儀時排隊等太久。溫度循環(huán)是所有PCR的基礎(chǔ)。儀器的變溫速率將決定PCR運行的整體速度。毫無疑問，變溫越快，PCR運行也越快。宣傳資料往往也會首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀運行速度更快。因此，在拿到參數(shù)表時，我們*時間會留意變溫速率，也就是升降溫速率。

　　不過，如果大家留心看，通常會發(fā)現(xiàn)ramp rate前面還會有一個Max，這說明制造商公布的是zui大變溫速率。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運行過程中，上述zui大性能只在極短的時間內(nèi)可達到，那種掐著秒表來計算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠意的制造商還會公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate)，表示在較長的變溫范圍內(nèi)溫度變化的速率。這個參數(shù)沒那么炫目，但更具參考意義，具有比較價值。

　　當然，樣品的變溫速率可沒有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水，爐子很快就達到100oC以上，但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時間。因此，只根據(jù)模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準確。Applied Biosystems在這一點上就很周道，提供了另一種參數(shù)，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個參數(shù)能反應(yīng)儀器根據(jù)體積來控制樣品達到設(shè)置溫度、遵循預(yù)設(shè)的實驗方案運行的真實能力，更有效地評估PCR儀的真實性能。

　　以Applied Biosystems ProFlex? PCR系統(tǒng)為例，96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達到6.0oC/秒，而標示樣品的zui大變溫速率也達到4.4oC/秒(1 μl樣品體積)。配合快速PCR試劑，擴增500 bp的片段，不到半小時即可完成。它采用溫度控制算法將樣本體積及反應(yīng)管的厚度考慮在內(nèi)，其實際模塊溫度高于設(shè)置點，從而使滯后的樣本溫度能夠更快地達到設(shè)置點(又稱為模塊熱過沖)。算法要才可根據(jù)不同體積使樣本達到穩(wěn)定的設(shè)置點溫度且無過沖及相關(guān)的負面效應(yīng)。

　　溫控準確

　　對于PCR反應(yīng)而言，zui重要的莫過于溫度控制的準確性。由于PCR是一個幾何級數(shù)擴增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火而言溫控顯得尤為重要。有時，退火溫度相差1oC，就能帶來迥然不同的結(jié)果。目前，市場上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準確性在±0.2oC左右。

　　溫度控制算法的性無疑會影響溫度控制的。前面提到的模塊熱過沖，需要非常豐富的經(jīng)驗，的算法才可使不同體積的樣本達到穩(wěn)定的設(shè)置點溫度且無過沖及相關(guān)的負面效應(yīng)。

　　對于96孔板PCR儀來說，另一個重要的參數(shù)是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要，在實驗設(shè)計時常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那么我們自然無法通過比較兩個不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù)，而得到可靠的結(jié)論。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S，在20-72oC時，均一性≤ ±0.3oC，在95oC，均一性≤ ±0.4oC。

　　對于梯度PCR而言，溫度準確性的要求似乎更高。梯度PCR儀zui先由Eppendorf公司在1998年研發(fā)成功推向市場(Mastercycler Gradient)。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次反應(yīng)就可以篩選出的退火溫度，優(yōu)化實驗，在節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間。

　　傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個Peltier元件組成，對它們設(shè)置不同的溫度，通過熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度。不過，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學相互作用，無法實現(xiàn)真正的線性梯度。實際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實退火溫度，尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗時。

　　Applied Biosystems在這方面就有獨到的設(shè)計，它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個獨立的加熱/冷卻模塊，由溫度控制器單獨控制。各個Peltier模塊之間用隔熱材料進行物理隔離，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾zui小化，溫度控制更加。VeriFlex技術(shù)可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致，確保優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件在隨后的日常運行中也表現(xiàn)出一致的結(jié)果。

　　研究人員的另一個噩夢是PCR反應(yīng)會蒸發(fā)。這種蒸發(fā)現(xiàn)象使PCR反應(yīng)體系中各組分濃度升高，特別是引物濃度升高，直接導(dǎo)致非特異性擴增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀則采用vapo.protect技術(shù)，防止PCR反應(yīng)體系的蒸發(fā)。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材，各種不同形狀的PCR耗材都能實現(xiàn)覆蓋。這種技術(shù)提高了結(jié)果的重復(fù)性，是小體積擴增的理想之選。Applied Biosystems則是通過熱蓋的自動調(diào)節(jié)和凹形設(shè)計確保PCR管的密封，基本上市場面上常見的PCR耗材都可以使用。當然，通常廠家會建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材，畢竟是經(jīng)過廠家多重測試的，肯定也不會錯。

　　靈活更換

　　雖說PCR儀已逐漸設(shè)計成個人化的儀器，但真的是實驗室中人手一臺，顯然并不太實際。實驗室中通常有多個課題，每個人的應(yīng)用也各不相同，因此PCR儀能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數(shù)人的選擇，但未來有什么樣的需求，當下并不清楚。抱著開放的心態(tài)，選擇一臺靈活的PCR儀，也許是明智的。

　　許多PCR儀都允許更換樣品模塊，包括96孔、雙48孔和384孔等。對于有些儀器，各個模塊之間是獨立的，就像多臺PCR儀一樣，可設(shè)置不同的運行程序。比如，Applied Biosystems的ProFlex PCR系統(tǒng)就提供3 x 32孔獨立模塊，允許同時運行3組實驗，每組*獨立，互不干擾。這種設(shè)計提高了效率，讓苦苦等待成為過去。另外，除了標準的96孔模塊，它還提供雙96孔和雙384孔模塊，滿足高通量的測序需要。此外還有雙槽式模塊可供選擇，支持QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)使用的芯片

　　Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀也提供4個可互換的模塊，包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應(yīng)管，使反應(yīng)體積zui高可達125 μl。這種大的反應(yīng)體積適合新一代測序或芯片的樣品制備。

　　美好體驗

　　性能要，操作可得簡單，這也是PCR儀選購時一個重要的考慮因素。畢竟，實驗室里用戶的水平參差不齊，既有經(jīng)驗豐富的老手，也有剛剛?cè)腴T的新手。操作直觀、輕松編程，相信是每個人的愿望。

　　幸運的是，如今的制造商在設(shè)計時都考慮到這一點，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習慣，但大多數(shù)人享受著這種隨便點點就能設(shè)置好程序的過程。之前，Veriti PCR儀作為市場上*款觸摸屏PCR儀，在推出時就受到很多客戶的歡迎。斯坦福大學的博士后Hugo Hilton曾表示：“觸摸屏顯示很直觀，讓用戶對反應(yīng)過程一目了然。"隨后Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀。隨著觸摸屏技術(shù)的快速發(fā)展，越來越靈敏、能快速反應(yīng)的PCR儀也隨之產(chǎn)生，比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp，那感覺和iPad是一樣一樣的。

　　遠程訪問也增強了用戶體驗，它讓用戶能夠通過智能手機或平板電腦，調(diào)整操作并查看初步結(jié)果。在使用ProFlex PCR系統(tǒng)時，你就能通過免費的My ProFlex手機客戶端，從你的辦公室、會議室、家里，甚至其他任何地方進行遠程連接，查看PCR實驗的運行情況，或查看哪個模塊可以使用。

　　隨著PCR的應(yīng)用越來越廣泛，人們也希望將PCR儀帶出實驗室，帶到診所和田間。一些制造商也推出了便攜的PCR儀，如Ahram Biosystems。不過，在大多數(shù)情況下，儀器還是擺在擁擠的實驗臺上。而且，一些必要的組件是不可少的，比如加熱元件、電源等。因此，高性能的PCR儀還是占有一定的體積。不過，如今連測序儀都跟U盤一般大了，還有什么是不可能的呢。

　　過去三十年，PCR已經(jīng)帶給了我們很多的驚喜。未來，儀器性能會更高，操作會更簡便，功能會更多樣，只是，選擇會更困難。擦亮雙眼，看看你真的需要什么，再做決定吧。